Address reprint requests to Jae Woo Kim, MD, PhD Department of Ophthalmology, Daegu Catholic University School of Medicine, #33 Duryugongwon-ro 17-gil, Nam-gu, Daegu 42472, Korea 장기이식의 면역억제제로 사용되고 있는 싸이클로스포린 A (cyclosporine A, CSA)는1 전신적으로 사용할 경우 신장 손상과 고혈압을 비롯한 여러 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있다. 싸이클로스포린에 의한 전신 부작용의 기전으로 혈관내피세포 등에서 일산화질소(nitric oxide, NO)의 대사과정에 영향을 미쳐 유발되는 산화스트레스에 의한 것으로 알려져 있다.2-5 녹내장의 경우 섬유주에서의 산화스트레스의 증가는 섬유주의 손상을 유발하여 개방각녹내장을 유발하는 요인으로 알려져 있다.6,7
CSA는 안과 영역에서 국소적 점안제로 건성안 치료에 많이 사용되고 있는데 CSA를 국소적으로 점안할 경우 안구 내 조직으로 침투하여 작용한다.8 따라서 방수에서 CSA는 NO의 생성을 저하시키고 산화스트레스를 유발하여 섬유주를 통한 방수 유출을 저하시킴으로써 안압에 영향을 줄 가능성이 있다. 녹내장이 없는 건성안 환자를 대상으로 한 이전의 연구에서는 CSA가 안압을 상승시키지는 않는 것으로 보고되어 있으나9-11 녹내장을 동반한 건성안 환자에서 CSA가 안압에 미치는 영향은 아직 보고되지 않았다.
이에 따라 본 연구에서는 사람의 섬유주세포를 일차배양하여 섬유주세포에서 CSA가 NO 생성에 미치는 영향과 반응성 산소종(reactive oxygen species, ROS)의 생성에 미치는 영향, 그리고 섬유주를 통한 방수유출에 미치는 영향을 실험적으로 알아보자 하였으며, 또한 임상적으로 녹내장 약물 치료 중 건성안으로 진단받고 국소적 CSA를 사용한 환자를 대상으로 CSA에 의한 안압의 변화를 알아보고자 하였다.
대상과 방법
세포배양과 약물처리
본 연구는 대구가톨릭대학교병원 의학윤리심의위원회(Institutional Review Borad)의 승인을 받았고(승인번호:CR-24-018-L) 헬싱키 선언을 따라 시행되었다. 상용의 사람 일차 섬유주세포(Cat. No. 6590; ScienCell, San Diego, CA, USA)를 해동하여 항생제와 10% 우태아혈청이 포함된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 배지를 사용하여 5% CO2배양기에서 배양한 후 트립신 처리하여 계대 배양하였다. 배양된 사람의 섬유주세포를 트립신 처리하여 1일간 배양접시에 부착시킨 후 1.0, 10 μM CSA(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에 24시간 노출시켰다. 이때 NO 생성의 기질로 작용하는 100 μM L-arginine(Sigma-Aldrich)에도 노출시켰다.
Endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) mRNA 발현을 측정하기 위한 RT-PCR
CSA에 노출시킨 섬유주세포에서 Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 RNA를 분리한 후 분리된 RNA에서 mRNA의 발현을 RT-PCR을 이용해 확인하였다. 섬유주세포에서 분리한 RNA와 Oligo dT primer, Nuclease-free water를 혼합하여 만든 RNA denaturation mix를 denaturation 시킨 다음 Prime RT premix (Genet bio, Seoul, Korea)와 혼합하여 cDNA로 합성하였다. 합성한 cDNA에 2XGoTaq Green Master Mix (Promega, Fitchburg, WI, USA)와 10 pM의 primer를 각각 혼합하여 DNAEngine cycler (Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 총 30 cycles를 시행한 후 5분간 반응시켰다. 증폭된 PCR 산물을 1% agarose gel에 전기영동하여 DNA band를 multi Gauge v2.02 (Fujifilm, Tokyo, Japan)을 이용하여 각각 분석하였으며 이때 β-action을 internal standard로 사용하였다.
eNOS 단백의 활성을 보기 위한 Western blot
단백질 추출에는 RIPA buffer (Thermoscientific, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였다. Cell lifter (Corning, Acton, MA, USA)로 세포를 모아 원심 분리하여 상층액을 모아 -80°C에 보관하였으며 단백질량은 BCA protein assay reagent kit(Thermoscientific)를 사용하여 측정하였다. 정량한 샘플을 같은 양으로 NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen)에 전기영동한 후 Xcell Surelock (Invitrogen)을 이용하여 니트로셀룰로오스 막(Invitrogen)에 transfer한 다음 막 차단용액(Invitrogen)에서 정치배양하였다. 상온에서 비특이적 반응을 1시간 동안 차단한 다음 일차항체로 4°C에서 하룻밤 동안 블롯 하였다. Goat Anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated된 이차 항체(Santacruz, Dallas, TX, USA) 를 막 차단 용액에 1:3,000으로 희석하여 처리하고 상온에서 1시간 반응시켰다. 항체를 반응시킨 막을 SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermoscientific)를 이용하여 Gel Doc XR+ (Bio-rad)로 단백의 발현량을 확인하였다. 이때 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 를 internal standard로 사용하였다.
반응성산소종(ROS)과 Superoxide의 생성 측정
ROS의 생성 정도는 dichlorofluorescein assay로 측정하였다.15 96-well 배양접시를 이용하여 약물처리한 세포배양에서 배지를 제거한 다음 5 μM dichlorofluorescein diacetate (Sigma-Aldrich)를 투여한 다음 암실에서 30분간 배양하였다. 산화된 dichlorofluorescein의 형광변화를 excitation 파장 488 nm, emission 파장 527 nm에서 형광분석계(FLUOstar OPTIMA; BMG Labtech, Offenburg, Germany)를 이용하여 측정하였다. Superoxide의 생성 정도는 modified cytochrome C assay로 측정하였다.16,17 160 μM cytochrome C (Sigma-Aldrich)와 100 U/mL superoxide dismutase (Sigma-Aldrich)를 혼합한 반응용액 100 mL에 CSA로 처치한 세포를 20분 간 노출시켰다. 540 nm에서 환원된 cytochrome C를 측정하였다. 106개의 세포에 대해 시간당 환원된 cytochrome C의 양(nmol)을 2.1 × 104/M/cm의 net extinction coefficient로 생성된 superoxide의 양을 nmol/106cell/h로 나타내었다.
섬유주단층세포층의 투과도 측정
섬유주 투과도를 측정하기 위하여 Trans-epithelial electrical resistance (TEER) assay를 시행하였다.18 섬유주세포가 내측 chamber에 충만하게 배양한 다음 CSA에 24시간 노출시킨 후 TEER을 epithelial voltohmmeter (EVOM2; World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA)를 이용하여 측정하였으며 그 결과를 net value (Ω cm2)로 기록하였다.
결 과
CSA가 섬유주단층세포층의 투과도에 미치는 영향
1.0 μM CSA는 약물에 노출시키지 않은 대조군에 비하여 섬유주단층세포층의 저항도에 유의한 영향을 미치지 않았으나 10 μM CSA는 저항도를 증가시켰으며(p=0.045), 10 μM CSA에 의한 이러한 저항도의 증가는 L-arginine을 함께 노출시킨 경우에는 나타나지 않았다(Fig. 7).
국소적 CSA 점안이 건성안을 동반한 녹내장 환자의 IOP 변화에 미치는 영향
녹내장 안압하강제를 사용 중인 환자들 중 건성안으로 진단받고 6개월 이상 국소적 CSA를 점안해 온 녹내장 환 자 18명 18안이 조사대상에 포함되었다(Table 1). CSA를 사용하기 전 평균 안압은 13.6 ± 3.10 mmHg이었으며 6개 월 이상 CSA를 사용한 후 마지막 추적 관찰 당시의 평균 안압은 13.1 ± 3.61 mmHg로서 유의한 차이를 보이지 않았 다(p=0.365). 녹내장 사용 약물의 개수는 1.19 ± 0.4개에서 1.63 ± 0.7개로 0.44개 증가하였으나 유의한 차이는 보이지 않았다(p=0.163).
고 찰
섬유주는 방수 내의 산화스트레스에 항상 노출되어 있는데7 산화스트레스가 증가하게 되면 섬유주세포는 구조적, 기능적인 손상을 받게 되며,19,20 이는 개방각녹내장의 발병 기전의 하나가 된다. 섬유주를 통한 방수 유출의 조절에서 NO가 중요한 역할을 하는데, NO의 생성이 감소하면 섬유주의 수축으로 인해 방수유출이 저하될 뿐만 아니라 산화 스트레스를 유발하여 섬유주 조직에 손상을 줄 수 있다.21-23
장기이식에서 면역반응을 억제하기 위해 전신적으로 사용되어 온 CSA는 신장 독성이나 고혈압 등의 다양한 전신 부작용을 유발하는데 그 주된 기전은 NO의 생성저하에 의한 산화스트레스에 의한 것으로 알려져 있다. 따라서 안과 영역에서 건성안의 치료를 위해 국소적으로 사용되는 CSA 제재들도 안구 내 섬유주의 NO 생성을 저하시켜 산화스트레스를 유발할 수 있을 뿐만 아니라 방수유출을 저하시켜 안압에 영향을 미칠 가능성이 있을 것이다.
이를 규명하기 위해 시행한 본 실험의 결과에서 CSA는 고농도에서 섬유주세포의 생존과 NO의 생성을 감소시켰으며 eNOS mRNA와 eNOS 단백의 활성을 감소시켰다. 산화 스트레스의 유발 정도를 조사한 결과 CSA는 섬유주세포에서 ROS의 생성을 증가시켰으며 섬유주를 통한 투과도를 저하시키는 경향을 나타내었다. CSA에 의한 이러한 변화는 ROS를 감소시키는 작용을 하는 L-arginine에 의해 상쇄되었으므로 섬유주에서의 산화스트레스에 의한 것임을 알 수 있었다. 산화스트레스 외에 CSA의 또 다른 작용 기전으로 CSA가 calcineurin 저해제로 작용하여 수축 등이 유발될 가능성도 있겠으나1 이전의 연구들에서 CSA는 calcineurin 저해제로 작용하여 세포 내 칼슘 농도에 미치는 영향은 미미하므로, CSA의 주된 작용 기전은 산화스트레스의 유발에 의한 것으로 밝혀져 있다.24-26
본 연구의 결과는 CSA가 섬유주세포에 직접적으로 노출될 경우 섬유주세포에 NO의 생성을 저하시키고 산화스트레스를 유발하여 섬유주의 손상을 유발함으로써 결과적으로 안압 조절에 부정적 영향을 미칠 가능성이 있음을 시사하고 있으나 실제 임상적으로 CSA가 안압상승을 유발한다는 명확한 결과는 아직 보고되지 않았다.9-11 CSA가 안압에 미치는 영향에 관한 이전의 연구들은 녹내장이 없는 건성안 환자들을 대상으로 한 결과인데 녹내장의 경우 섬유주의 기능이 저하되어 있을 수 있으므로 본 연구에서는 녹내장을 동반한 건성안 환자들을 대상으로 국소적 CSA가 안압의 변화에 미치는 영향을 조사하였으며, 그 결과 녹내장이 있는 경우에도 안압의 변동에는 유의한 영향을 미치지 않은 것으로 나타났다. 녹내장 치료에 사용한 안압하강제의 개수는 유의한 차이를 보이지 않았으므로 CSA가 안압에 미치는 영향에서 안압하강제의 영향은 배제할 수 있을 것이다. 본 연구의 이러한 결과는 섬유주절제술 전후에 CSA 점안제의 사용이 안압과 여과포의 생존에 유해한 영향을 미치지 않았다는 이전의 결과와도 일치한다고 볼 수 있다.27
따라서 CSA가 실험적으로는 섬유주세포에서의 NO의 생성 감소와 함께 산화스트레스를 유발하며 섬유주를 통한 방수 유출을 감소시킬 가능성이 있으나 녹내장의 유무와 상관없이 국소 CSA의 점안은 안압의 변화에 유의한 영향을 미치지 않았다. 이렇게 CSA의 안압에 대한 영향이 실험실 내 결과와 임상적인 결과와 다르게 나타나는 이유로는 국소적으로 CSA를 점안할 경우 점안한 CSA의 대부분이 각막 실질에 침착되기 때문에 각막의 투과도가 매우 낮아 실제 전방 내에서 섬유주에 직접적으로 작용하는 CSA의 농도가 매우 낮기 때문으로 생각된다.28-31
결론적으로 CSA는 NO의 생성과 eNOS의 활성을 저하시켰으나 녹내장 환자에서 건성안에 대한 국소 CSA 점안제의 장기간 사용은 안압의 변화에 유의한 영향을 미치지 않았다. 따라서 CSA가 섬유주의 산화스트레스를 유발할 수 있으나 임상적으로는 CSA의 국소적 사용으로 사용하더라도 CSA의 각막 투과성이 낮아서 섬유주의 유출과 안압에 미치는 영향은 적을 것으로 생각된다.
PDF Links
PubReader
ePub Link
XML Download
Full text via DOI
Download Citation
Print
