Assessment of corneal edema

각막투명도는 내피손상 후 1일, 1주, 2주, 4주에 평가하였다. 각막부종으로 인한 혼탁의 중증도는 이전에 Yoeruek et al26에 사용된 기준에 따라 평가하였으며 다음과 같다. grade 0, 투명한 각막; grade 1, 경미한 각막혼탁; grade 2, 홍채 세부 구조는 흐릿하지만 홍채와 렌즈 구분이 가능; grade 3, 홍채와 렌즈가 거의 보이지 않음; grade 4, 홍채와 렌즈를 식별할 수 없음. 혼탁 정도 값(n=5)은 수술 후 추적 기간에 평가되었다. 중앙각막두께(central corneal thickness, CCT)는 조직을 뗀 직후 캘리퍼로 측정되었다.

Vital staining

Alizarin red와 trypan blue로 vital staining을 시행하였다. 각막을 trypan blue로 염색하여 손상된 원형질막이 있는 세포를 나타내고 alizarin red로 염색하여 세포 경계를 확인하였다.27 각막내피표면을 90초 동안 0.9% NaCl 중 0.2% trypan blue로 염색하였다. 이어서, trypan blue를 0.9 % NaCl로 부드럽게 세척하고 0.9 % NaCl (pH 4.2) 중 0.2 % alizarin red로 90초 동안 염색하였다. 과량의 염료를 제거하기 위해 다시 한 번 0.9% NaCl로 세척 후, 각막을 2.5% glutaraldehyde에서 10분 동안 고정시켰다. 각막을 지지대에서 분리하고 공막 및 결막 조직을 다듬었다. 각막을 슬라이드에 놓고 0.9 % NaCl 방울이 있는 커버슬립을 덮은 뒤 각막을 평평하게 하기 위해 커버슬립을 슬라이드에 테이프로 붙였다. 내피는 CKX41 microscope (Olympus, Tokyo, Japan)에서 투과광으로 관찰하였으며 중앙 및 주변 영역의 사진을 획득하였다.

Immunofluorescence staining

적출된 안구는 매립 배지(Tissue-Tek OCT Compound, Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA, USA)에서 즉시 취하였으며, 절편을 저온 유지 장치에서 10 μm 두께로 절단하고 tape system을 사용하여 잠재적인 compression artifact를 피하기 위해 유리 슬라이드로 옮기고 실온에서 15분 동안 건조시켰다. 절편의 중심은 동공과 시신경을 통해 판단하였다. 각막두께는 각 군의 5안에서 측정하였으며 1안에서 2-4개의 절편을 측정하였다. Collagen VIII alpha2 (COL8A2), alpha-smooth muscle actin (α-SMA), Na⁺-K⁺ ATPase 및 terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)의 면역형광염색을 수행하였다. 샘플들은 3.7% formaldehyde solution에 20분 동안 고정되었다. 슬라이드를 0.5% Triton X-100으로 10분 동안 투과시키고 실온에서 1% bovine serum albumin으로 1시간 동안 처리하였다. 세척 후, 슬라이드를 goat anti-human COL8A2 antibody (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA), rabbit anti-human α-SMA antibody (Abcam, Cambridge, MA, USA) 또는 mouse anti-human Na⁺-K⁺ ATPase (Santa Cruz)와 함께 4°C에서 밤새 배양한 후 PBS로 세척하였다. 세포를 암실에서 37°C로 1시간 동안 fluorescein isothiocy anateconjugated goat anti-rabbit 눈꺼풀뒤당김 교정술 immunoglobulin G antibody, rabbit anti-goat antibody, 또는 rabbit anti-mouse antibody (1:100)와 함께 배양한 다음 핵을 구분하기 위해 Hoechst dye (1:2,000; Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하였다. 인산완충용액으로 세척한 후 슬라이드를 mounting media에 장착하였다. 음성 대조군 염색은 1차 항체의 생략하고 동시에 수행하였다.

Apoptosis 세포의 확인은 TUNEL 시스템 키트(Promega GmbH, Mannheim, Germany)를 사용하여 수행하였다. TUNEL 염색은 면역염색을 위해 위에서 설명한 대로 수행되었지만 proteinase-K (20 μg/mL, Promega GmbH)와 함께 37°C에서 추가로 10분 배양하고 TdT 반응 전에 추가 고정 단계를 수행하였다.

사람 각막내피세포와 기질세포의 배양

사람 각막내피세포와 각막기질세포는 전체층각막이식술 후 버려진 각막-공막 고리에서 얻었으며, 조직은 배양을 위해 처리될 때까지 4°C에서 Optisol^™-GS (Bausch and Lomb Inc., Rochester, NY, USA)에 보관되었다. 세포배양은 이전에 기술된 바와 같이 시행하였다.28,29 사람각막내피세포는 사망 후 7일 이내에 획득하였으며 데스메막을 보존하였다. 사람 각막내피세포 및 데스메막 복합체를 0.02% ethylenediaminetetraacetic acid solution에서 1시간 동안 배양하고 열처리된 피펫으로 강하게 교반하여 세포 접합부를 파괴하고 3,000×g에서 5분 동안 원심분리하였다. Bovine fibronectin (10 mg/mL) 및 bocine type I collagen (35 mg/mL)을 함유하는 FNC coating mix (Athena Enzyme System, Baltimore, MD, USA)로 코팅된 배양 플레이트에 세포를 파종하였다. 그런 다음 세포를 8% fetal bovine serum (FBS; Cambrex Bio Science, Walkersville, MD, USA), 200 mg/L의 CaCl2, 0.08% chondroitin sulfate (both from Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA), 20 mg/mL ascorbic acid (Sigma Chemical Co.), 100 mg/mL pituitary extract (Invitrogen, Grand Island, NY, USA), 5 ng/mL EGF, 20 ng/mL nerve growth factor (both from Sigma Chemical Co.), 10 mg/mL gentamicin (Invitrogen), 100 IU/mL penicillin, 100 IU/mL streptomycin 및 2.5 mg/mL amphotericin (both from Cambrex Bio Science)이 첨가된 OptiMEM-I 배지에 5% CO₂ 습윤 하에서 배양하였으며 배지는 격일로 교체하였다. 각 계대 후 배양된 세포의 합류지점에서 성장 영역의 범위가 3배가 되도록 하였으며 passage 3의 세포를 실험에 사용하였다.

각막기질세포는 사망 후 7일 이내에 획득하였다. 데스메막과 상피는 집게와 안과용 칼을 사용하여 제거하였고 각막의 기질은 절편을 만들었다. 중간 기질 및 후방 기질을 배양 배지에 현탁시키고 24-well 플레이트에서 배양하였다. 각막기질을 4분의 1로 절편으로 만들어 37°C에서 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)에서 2 mg/mL collagenase (Roche, Basel, Switzerland)로 하루 동안 분해하였다. 분리된 세포를 DMEM으로 세척하고 10% FBS가 보충된 DMEM/F12에서 배양하였다.

사람 각막내피세포와 기질세포의 공배양

사람 각막내피세포와 각막기질세포는 Transwell system (Corning Inc., Lowell, MA, USA)에서 공동배양되었다. 사람 각막내피세포는 상부의 0.4 μm 필터 막에서 배양되었고 각막기질세포는 apical chamber 없이 Transwell의 각 well 바닥에 well당 100,000개 세포의 밀도로 배양하였다. 이어서 배양된 사람 각막내피세포를 각막기질세포 유무에 관계 없이 Transwell로 옮겼다. 배지를 serum-free DMEM으로 교체하고 세포를 48시간 동안 배양하였다. 상처 치유 분석을 위해 사람 각막내피세포 단층을 멸균된 10 μL 피펫 팁 (TipOne, USA Scientific, Ocala, FL, USA)으로 긁어 세포를 제거하여 두 개의 수직의 선형의 상처를 만들었다. SPOT 디지털 카메라가 장착된 도립 Zeiss 현미경으로 동일한 지점에서 상처 직후 및 24시간 후에 사진을 찍었다. 치유 정도는 원래 상처 부위와 남아있는 상처 부위의 차이 대 원래 상처 부위의 비율로 정의하였다. 공동배양 조절 배지의 단백질 함량은 bicinchoninic acid (BCA) protein assay (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA)를 사용하여 결정하였다. 모든 분취액은 사용할 때까지 -80°C에서 보관하였다.

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

배지 내 TGF-β1 및 IL-6 농도는 double-sandwich ELISA로 측정하였다. 사람 각막내피세포 배양 배지, 각막기질세포 배양 배지 및 사람 각막내피세포 및 각막기질세포 공동 배양 배지 내 TGF-β1 및 IL-6 농도는 제조업체의 프로토콜에 따라 시판되는 human TGF-β1 및 IL-6 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 분석하였다. 각 ELISA의 민감도 한계는 ~7.8 pg/mL였다. 간략하게, anti-human TGF-β1 및 IL-6 항체를 96-well 플레이트의 각 well에 첨가하고 실온에서 밤새 incubation하였다. 다음 날 각 well을 세척 완충액으로 헹구었다. 그런 다음 모든 well을 1% bovine serum albumin을 포함하는 blocking buffer (pH 7.4)로 채우고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. human TGF-β1 및 IL-6 또는 실험 샘플의 표준 희석액 100 uL를 적절한 polyclonal 항체로 코팅된 96-well 플레이트에 분배하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 2시간 동안 incubation하였다. 이어서, 플레이트를 4회 세척하고, horseradish peroxidase에 접합된 goat anti-human TGF-β1 및 IL-6 100 μL를 각 well에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 항체-항원 복합체를 100 µL의 3,30,5,50-tetramethylbenzidine으로 20분간 파란색으로 염색한 후 50 µL의 1 M H2SO4를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 흡광도는 automatic plate reader를 사용하여 기준 파장 570 nm로 파장 450 nm에서 측정하였다. 사이토카인 농도는 BCA protein assay kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)로 측정한 총 단백질 농도를 기준으로 하였다.

Statistical analysis

통계는 Kruskal-Wallis test와 Mann-Whitney U test를 사용하여 실험적 차이의 통계적 유의성을 평가하였으며 p<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

각막부종 및 혼탁도 측정

0.05 N NaOH를 10분간 토끼 각막내피세포에 접촉하였을 때 각막부종이 발생하였고 감소 추세를 보였다(Fig. 1A). 0.5 N NaOH로 10분간 처리하였을 때에는 심한 각막부종과 혼탁이 지속하였고 14일째에 각막신생혈관이 발생하였다(Fig. 1B). 각막부종은 대조군에 비해 손상 후 1일에 유의하게 증가하였다(p=0.008) (Fig. 1A, C). 각막부종은 시간 경과에 따라 감소하였고 대조군과 비교하여 28일째 CCT에는 차이가 없었다(Fig. 1C). 각막혼탁도는 대조군에 비해 1일차에 증가하였고(p=0.008), 14일차와 28일차에는 1일차에 비해 감소하였다(p=0.008 and 0.008, respectively) (Fig. 1D). 그러나 각막혼탁도가 대조군에서 관찰된 수준으로 되돌아가지는 않았다(p=0.008).

Figure 1.

Corneal edema and opacity after chemical corneal endothelial injury in rabbits. (A) Changes in the cornea after chemical endothelial injury. (B) Corneas treated with high concentration or long duration of NaOH. (C) Corneal edema increased at day 1 and decreased until day 28 but did not achieve levels observed at baseline. (D) Corneal opacity decreased from day 1 until day 28. *Statistically significant by Mann-Whitney U test.

Alizarin S red와 trypan blue를 이용한 vital staining

각막내피세포는 vital staining으로 평가되었다. 중앙 및 주변 영역의 각막내피세포는 손상 후 1일차에 파괴되어 사라진 상태였다. 중심부는 살아 있는 세포가 없는 손상 상태로 남아 있었고, 주변부는 큰 세포가 나타나 먼 주변부에서 이동하여 7일 후에 손상에서 회복되었다. 세포가 주변에서 중심으로 이동하기 시작하여 주변부 세포의 integrity가 회복되기까지는 손상 후 14일이 걸렸다. 손상 후 28일까지 주변부 세포가 회복되었고 중앙 세포의 회복은 불완전하였지만 진행되었다(Fig. 2A). 손상 14일 후의 각막내피세포는 주변부 영역에서 세포의 크기가 작았고 다각형의(polygonal) 모양과 높은 밀도를 보인 반면 중심 영역에서는 더 크고 불규칙한 모양을 나타냈다(Fig. 2B).

Figure 2.

Vital staining of rabbit corneal endothelium with alizarin S red and trypan blue after injection of 0.1 mL of 0.05 N NaOH. (A) Corneal endothelial cells in both the central and peripheral areas were damaged at day 1. At day 7, central cells were damaged and peripheral cells migrated from the far periphery and recovered from damage. At day 14, peripheral cells recovered cell integrity and central cells migrated from the periphery and recovered. At day 28, peripheral cells recovered from the damage and recovery of central cells progressed from day 14. (B) Corneal endothelial cells were small and of polygonal shape and exhibited high density at the periphery and were larger and of irregular shape in the center at day 14. Scale bar = 100 μm.

헤마톡실린-에오진 염색과 TUNEL 염색

각막내피에 대한 알칼리성 손상은 손상 후 1일째에 각막내피세포의 박리 및 apoptosis를 초래하였다(red arrows in Fig. 3). 그 이후에는 각막내피에서 apoptosis 세포가 관찰되지 않았다. 한편 기질세포에서는 apoptosis 세포가 검출되지 않았다. 소수의 근섬유아세포가 손상 후 1일째에 α-SMA에 대한 면역형광염색에 의해 확인되었지만 α-SMA는 기질에서는 관찰되지 않았다(Fig. 3). 마찬가지로 데스메막에에서도 α-SMA를 발현하지 않았다.

Figure 3.

Hematoxylin and eosin (H&E), terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) staining, and immunofluorescence with a α-smooth muscle actin (α-SMA). Alkaline injury to corneal endothelium led to the detachment and apoptosis of endothelial cells at day 1 after injury (red arrows). There were no apoptotic cells observed after this point. Immunofluorescence staining for α-SMA showed only a few myofibroblasts at day 1 and no cells stained with α-SMA were found in the stroma subsequently. The cells on the Descemet's membrane were not stained with α-SMA. Scale bar = 100 μm.

동결절편의 면역형광염색

데스메막은 COL8A2에 대한 항체로 염색하였다(Fig. 4). 손상 1일 후 데스메막의 내측면에서 세포가 관찰되지 않았다. 7일과 14일에 각막내피세포는 데스메막의 중심이 아닌 주변부에서 검출되었으며 28일째에 세포는 데스메막 전체에서 관찰되었다. Na⁺-K⁺ ATPase 염색은 데스메막에 있는 세포의 표현형을 조사하기 위해 수행되었다(Fig. 4). 손상 후 7일과 14일에 Na⁺-K⁺ ATPase를 발현하는 세포가 데스메막의 주변에서 관찰되었지만 중앙에서는 관찰되지 않았다. 28일째에 Na⁺-K⁺ ATPase를 발현하는 세포는 데스메막 전체에서 관찰되었다. 손상 후 1일째에 각막기질세포는 데스메막의 전면에서 검출되지 않았다. 손상 1일 후의 관찰과는 대조적으로, 데스메막의 전방 표면은 각막내피세포와 평행한 각막기질세포로 덮여 있었다(white arrows in Fig. 4).

Figure 4.

Descemet's membrane stained with antibody to COL8A2. Immunofluorescence staining of corneas with collagen VIII alpha 2 (COL8A2; A), and Na⁺-K⁺ ATPase (B). The anterior surface of Descemet’s membrane was lined by corneal stromal cells parallel to endothelial cells (white arrows). Scale bar = 50 μm.

Transwell system에서 각막내피세포와 각막기질세포 간의 사이토카인 분비 및 상호작용

Transwell system에서 각막내피세포와 각막기질세포 간의 상호작용을 조사하기 위해 사이토카인 분비를 평가하였다(Fig. 5A). TGF-β1은 각막기질세포 또는 각막내피세포의 개별배양보다 각막기질세포 및 각막내피세포의 공동배양에서 더 적게 분비되었다(p=0.008 for both) (Fig. 5B). IL-6 수치는 상부 공배양 chamber보다 하부에서 더 낮았다(p=0.008 for both) (Fig. 5C). 각막기질세포와 각막내피세포의 공배양은 각막기질세포 또는 각막내피세포의 개별배양보다 IL-6를 적게 분비하였다(p=0.001 for both).

Figure 5.

Transforming factor-β1 (TGF-β1) and interleukin-6 (IL-6) concentration in human corneal endothelial cell (HCEC) and corneal stromal cell (CSC) co-cultures or individual cultures. (A) HCEC at the insert membrane in upper chamber and CSC at the bottom in lower chamber. (B) TGF-β1 levels secreted by co-culture of CSCs and HCECs were lower than in individual cultures of CSCs or HCECs (p = 0.008 in both). IL-6 levels in the lower chamber of co-culture were lower than in the upper chamber (p = 0.008 in both). (C) IL-6 levels in co-cultures of CSCs and HCECs were lower than in individual cultures of CSCs or HCECs (p = 0.001 in both). *Statistically significant by Mann-Whitney U test.

상처 치유 분석

각막내피세포의 상처 회복률은 각막내피세포 단독배양에서보다 각막기질세포와 각막내피세포의 공동배양에서 더 높았다(p=0.016, Mann-Whitney U test) (Fig. 6A, B).

Figure 6.

Wound healing assay. (A) Wound closure rate in co-cultures of human corneal endothelial cells (HCECs) and corneal stromal cells (CSCs) was faster than in cultures of HCECs without CSCs. (B) Wound closure rate of HCEC cultures was higher in the co-culture system than in cultures of HCECs without CSCs (p = 0.016). *Statistically significant by Mann-Whitney U test. Scale bar = 100 μm.