Address reprint requests to Ho Sik Hwang, MD, PhD Department of Ophthalmology, Yeouido St. Mary’s Hospital, #10 63-ro, Yeongdeungpo-gu, Seoul 07345, Korea 인간의 몸에서 혈관 내의 혈류를 직접 관찰할 수 있는 곳은 많지 않다. 가능한 곳으로는 손톱 바닥(nail bed), 설하점막(sublingual), 결막 등이 있는데1-6 그중 결막미세혈관 내 혈류는 안과 진료용 세극등현미경에서도 쉽게 관찰할 수 있다. 그래서 결막미세혈관의 혈류는 겸상적혈구병,7-9 알츠하이머병,10 고혈압,11 저혈압,12 당뇨병과13,14 같은 전신 질환에서의 미세혈관 내 혈류 변화를 알아보는 데 쓰이고 있다.
특히, 결막의 미세혈관계의 혈역동학적인 변수들의 분석을 통해 심혈관 질환이나 뇌혈관 관련 질환들과의 연관성을 찾으려는 연구들이 증가하고 있으며 이러한 노력을 통해 심혈관 질환과 뇌혈관 질환들의 평가에 도움을 줄 수 있는 잠재적인 지표가 될 수 있을 것으로 생각된다.6
또한, Sun et al15은 콘택트렌즈 착용자, 안구건조증 환자, 결막종양 환자, 당뇨망막병증 환자에서 구결막미세혈관의 변화가 있을 수 있다고 하였으므로 이러한 질환들과의 연관성을 알아보기 위해서 구결막미세혈관을 관찰해 보는 것은 의미가 있겠다.
결막미세혈관 내 혈류 속도를 정량적으로 측정하고자 하는 시도가 있었다.16 그들은 Matlab 소프트웨어(The Mathworks Inc. Natick, MA, USA)를 이용한 공간-시간 이미지 분석법16을 사용하였다. 시간에 따른 혈관 내의 각 위치에서 신호 강도(signal intensity)를 그래프에 나타내어 그 기울기를 구하여 혈류 속도를 구하였는데 이는 안과의사가 사용하기에는 어려운 방법이다.
이번 연구에서 사람의 결막에서 미세혈관 내 혈류 속도를 정량적으로 측정하기 위해서 세극등현미경의 최고 배율인 40배보다 더 고배율의 줌렌즈를 세극등현미경에 장착하고 초고속 카메라를 사용하여 환자 구결막의 미세혈관 내 혈류의 속도를 측정할 수 있는 보다 직관적인 방법을 소개하고자 한다.
대상과 방법
피험자
본 연구는 헬싱키선언(Declaration of Helsinki)을 준수하였으며, 가톨릭의대 여의도성모병원 연구윤리심의위원회(Institutional Review Board, IRB)의 승인(승인 번호: SC20 DISI0032)을 받았다. 본 연구의 목적과 방법, 발생 가능한 부작용 등에 대해서 환자에게 설명하였으며 서면 동의를 얻었다. 2020년 8월 21일부터 2021년 6월 12일까지 가톨릭의대 여의도성모병원에 내원한 환자 중 본 연구의 참여에 동의한 환자로 구결막에 염증이 없고 최근 6개월간 안구수술을 받거나 외상을 당한 적이 없고, 인공누액을 제외한 안약을 사용하지 않았고 주시에 문제가 없는 총 10명(10안)이 연구에 포함되었다.
결막미세혈관 혈류 촬영
Basler사의 초고속 카메라(acA800-510uc, Basler Co., Ltd., Ahrensburg, Germany)와 줌렌즈(EDMUND VZMTM 100i zoom imaging lens, Edmund Optics Inc., Barrington, IL, USA)를 거치대를 이용하여 세극등현미경(Haag-Streit AG, Köniz, Switzerland)의 중심축에 장착하였다(Fig. 1). 광원은 세극등현미경의 텅스텐 광원을 그대로 사용하였다. 줌렌즈 앞에는 초록색 필터(Mounted M25.5×0.5 Threaded-Green Filter, Edmund Optics Inc.)를 장착하였다. 초록색 필터는 투과 파장 540 ± 5 nm이며 이는 붉은색의 적혈구가 더 잘 보일 수 있도록 한다. 줌렌즈의 배율은 8.6배로 하였다. 배율 2.5배에서 1 mm 눈금의 자를 촬영하여 8.6배에서는 1 mm가 1,600픽셀이라는 것을 확인하였다. 이 초고속 카메라의 프레임 속도를 구하기 위해 이 카메라로 스마트폰(Iphone 6s, Apple Inc., Cupertino, CA, USA) 스톱워치를 촬영하여 147프레임이 1초라는 것을 확인하였다. 이를 계산하면 1프레임당 0.0068초이다. 세극등현미경의 광원에서 나온 빛이 결막을 비추면 이 영상이 초록색 필터를 통과하고 줌렌즈를 통과한 다음에 초고속 카메라에 촬영이 된다(Fig. 1).
피험자는 세극등현미경의 턱, 이마 받침대에 얼굴을 고정한다. 환자에게 정면을 주시시킨 후 카메라가 연결된 컴퓨터 모니터를 보면서 줌렌즈를 앞뒤로 움직여 결막에 초점을 맞추었다. 환자의 구결막의 이측 또는 비측을 촬영하였다. 카메라에서 자동 이미지 향상 기능(auto image-enhancement)을 사용한 경우에는 그린필터를 사용하였어도 초록색이 아니라 일반적인 결막 색을 보였다. 초고속 카메라의 동영상 캡쳐 프로그램을 이용하여 10초 내외로 녹화하였다. 환자의 단안에서만 촬영하였다.
혈류 속도 정량화 방법
본 연구에서는 결막미세혈관 내 적혈구의 흐름을 촬영 후 이를 분석하여 혈류의 속도를 구하였다. 하나의 동영상에서 여러 군데의 혈관을 선택하여 속도를 측정하였다. 촬영한 동영상을 ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation [LOCI, University of Wisconsin])를 이용하여 분석하였다. 이 소프트웨어에서는 동영상의 1,400여 개의 프레임을 이미지로 볼 수 있다. 하나의 미세혈관에서 혈류가 끊김 없이 균일하게 흐르는 경우에는 특정한 적혈구를 따라가면서 속도를 측정하기 어려웠다. 그래서 미세혈관 내 혈류가 일부 끊겨 보이는 혈관을 찾았다. 즉, 혈류의 중간에 적혈구가 없어 붉게 보이지 않는 부분을 찾아 이를 추적하여 지나간 거리와 소요 시간을 측정하여 속도를 계산하였다.
촬영 중 눈의 비자발적인 움직임 때문에 프레임마다 미세혈관의 위치 이동이 있으므로 혈류가 끊겨 보이는 지점의 위치를 정확히 알 수 있도록 혈류 속도 측정 시작점이나 도착점이 특이한 위치(혈관의 분지, 두 혈관이 만나는 지점, 또는 혈관이 꺾이는 지점 등)에 있는 경우만 분석에 포함시켰다. Fig. 2A에서 빨간 화살표는 끊어진 혈류의 맨 앞을 가리킨다. 이 혈류가 진행하여 Fig. 2B에서처럼 노란색 화살표(서로 다른 두 개의 혈관이 교차하는 부분)에 도달할 때까지의 거리와 시간을 측정하였다. 빨간 화살표와 노란 화살표 사이의 거리는 Fig. 2C와 같이 ImageJ에서 분절된 선(segmented line)을 그려서 구하였다. Fig. 2C의 경우 이 혈관에서 적혈구가 움직인 거리는 0.021 mm였고 소요시간이 0.048초였으며 속도는 0.435 mm/s였다. 혈류의 움직임을 영상으로도 확인할 수 있다(Supplementary Video 1).
Fig. 3A에서 빨간 화살표는 끊어진 혈류의 맨 앞을 가리킨다. 이 혈류가 진행하여 Fig. 3B에서처럼 노란색 화살표(혈관의 주행이 급격히 변하는 지점)에 도달할 때까지 거리와 시간을 측정하였다. Fig. 3C의 경우 거리는 0.061 mm였고 소요 시간은 2.04초로, 속도는 0.044 mm/s였다. 혈류의 움직임을 영상으로도 확인할 수 있다(Supplementary Video 2).
통계
한 환자의 비디오에서 가급적 많은 측정을 하였으며 환자에 따라 하나의 비디오에서 13개까지 측정하였다. 혈류 속도의 히스토그램을 구하고 Kolmogorov-Smirnov test를 시행하여 정규분포를 하는지 알아보았다. 측정한 혈류 속도의 평균과 표준편차를 구하였다. 혈류 속도와 혈관의 직경 그리고 혈류 속도와 환자의 나이 간의 상관관계 분석을 위해 각 변수의 정규성에 따라, 피어슨(Pearson) 상관분석 또는 스피어만(Spearman) 상관분석을 시행하였다. SPSS® (version 22.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하였고, p값이 0.05 미만인 경우를 통계학적으로 의미 있는 결과로 정하였다.
결 과
이번 연구에는 10명의 환자가 포함되었고 모두 특별한 전신적 기저 질환을 가지고 있지 않았다. Table 1은 피험자의 성별, 나이, 진단명, 전신 질환, 분석에 사용한 미세혈관의 개수를 보여준다. 피험자들의 성별은 남자 1명, 여자 9명이었다. 본 연구에 참여한 총 10명의 나이는 정규 분포를 따르지 않았다(Kolmogorov-Smirnov test, p=0.00). 나이의 중앙값은 49.0세였으며 사분위수 범위는 39.5-64.5세였다.
총 53개의 혈관을 분석하였을 때 혈류 속도는 정규분포를 따랐으며(Kolmogorov-Smirnov test, p=0.20) (Fig. 4), 속도의 평균은 0.786 ± 0.468 mm/s였다. 결막미세혈관 직경은 정규분포를 따르지 않았으며(Kolmogorov-Smirnov test, p=0.00) 결막미세혈관의 직경의 중앙값(median)은 7.06 µm였으며 사분위수 범위 5.84-9.23 µm였다. Fig. 5A는 이번 연구에 포함된 결막의 미세혈관 직경과 혈류 속도와의 관계를 보여주는 그래프이다. 비모수 상관분석 결과, 결막의 미세혈관 직경과 혈류 속도는 통계학적으로 유의한 상관관계를 보이지 않았다(Spearman correlation analysis, p=0.177). Fig. 5B는 피험자의 나이와 혈류 속도와의 관계를 보여주는 그래프이다. 비모수 상관분석 결과, 피험자의 나이와 결막미세혈관 혈류 속도 또한 통계학적으로 유의한 상관관계를 보이지 않았다(Spearman correlation analysis test, p=0.669).
각 환자에 따라 분석한 이미지의 수가 다르기 때문에 각 환자의 미세혈관 혈류 속도의 평균 혈류 속도를 구해보았다(Fig. 6). 피험자의 나이와 나이에 따른 평균 결막미세혈관 혈류 속도 또한 통계학적으로 유의한 상관관계를 보이지 않았다(Spearman correlation analysis test, p=0.802).
고 찰
이번 연구에서는 줌렌즈와 초고속 카메라를 장착한 세극등현미경을 이용하여 결막 미세혈관 내의 혈류를 관찰하고 혈류 속도를 정량적으로 쉽고 직관적으로 측정할 수 있었다.
Shahidi et al16은 디지털 카메라(digital charged coupled device camera)와 초록색 필터를 장착한 세극등현미경으로 결막미세혈관 내 혈류를 촬영하고 그 이미지를 Matlab 소프트웨어(The Mathworks Inc. Natick, MA, USA)로 분석하여 결막미세혈관 내의 혈류 속도를 측정한 바 있다. 간단히 기술하면 미세혈관 내 혈류 속도는 혈관 내 적혈구의 움직임을 추적하여 측정하였고 적혈구 추적은 결막미세혈관의 공간-시간 이미지(spatial-temporal image)를 만들어 측정하였으며 결막혈관 이미지에서 각 혈관의 중심선을 따라 밝기(intensity)를 측정하여 그래프를 만들었다. 가로축에는 시간, 세로축에는 결막미세혈관의 중심선을 따른 밝기 값을 보여주는 칼럼을 표시하였다. 이렇게 만들어진 공간-시간 이미지에서 밝기가 비슷한 곳을 찾아 이어서 기울기를 구하고 그 기울기의 평균을 결막미세혈관 혈류 속도로 하였다.
Brennan et al6의 연구에서는 세극등현미경과 아이폰 6s (Apple Inc.)의 혈관 촬영 앱(Promovie Recorder)을 통해 결막 혈관을 촬영을 하였고, 결막미세혈관 내 혈류 속도는 공간-시간 이미지를 이용하여 Shahidi et al16의 방법과 동일하게 결막미세혈관 내 혈류 속도를 구하였다.
본 연구에서는 위 두 가지의 연구에서처럼 복잡한 이미지 처리, 수학적 및 통계적 계산, 함수가 사용되는 소프트웨어 사용 등의 복잡한 과정을 거치지 않았다. 본 연구에서는 초고속 카메라를 이용하여 혈류를 촬영하여 속도를 구하는 직관적인 방법을 사용하였다. 미세혈관 내 혈류가 일부 끊겨 보이는 혈관을 찾아 그 부위를 추적하여 지나간 거리와 소요 시간을 측정하여 속도를 계산하였다. 이러한 방법은 위에서 언급된 연구에서 사용한 방법에 비해 보다 쉽고 직관적이다.
Table 2는 본 논문에서 참고한 사람 결막미세혈관의 혈류 속도와 직경을 구한 논문의 데이터를 정리한 표이다. 사람의 결막혈관에 대해서 공간-시간 이미지를 사용하여 처음으로 결막미세혈관 혈류 속도 및 직경을 측정한 Shahidi et al16의 연구에서 결막미세혈관 혈류 속도가 0.7 mm/s인 것과 비교하였을 때 본 연구에서의 결막미세혈관 혈류 속도는 0.786 ± 0.468 mm/s로서 큰 차이가 없었다. 다만 이 방법에서는 미세혈관에서 혈류가 끊김 없이 균일하게 흐르는 경우에서는 속도를 구할 수 없어서 불연속적인 혈류가 있을 때만 측정할 수 있었기 때문에 측정한 혈관의 차이는 있을 수 있다.
본 연구에서는 혈관의 직경과 혈류 속도는 통계적으로 유의한 상관관계를 보이지 않았다(Spearman correlation analysis, p=0.177). Murray 법칙17에 따르면 혈관 내 혈류 속도(μ)는 혈관의 반지름(r)에 비례한다. 이 법칙에 따르면 혈관 직경이 클수록 혈관 내 혈류 속도가 커지는데 대체적으로 포유류의 미세혈관에서 직경이 크면 혈류 속도가 높았다.18 하지만 이러한 법칙이 토끼의 장간맥(mesenteric) 세동맥으로 연구한 작은 혈관 직경에서는 유효하지 않았다.19 Brennan et al6은 사람의 결막미세혈관의 직경이 클수록 혈류 속도가 증가하는 양의 상관관계를 갖는다고 보고하였다. Wang et al20도 사람의 결막미세혈관 직경과 혈류 속도는 양의 상관관계가 있다고 보고하였다(r=0.23, p<0.05). 반면, Koutsiaris18는 사람의 결막미세혈관의 직경과 혈류 속도가 반드시 양의 상관관계를 갖는 것은 아니라고 하였다. 그들은 직경이 5 µm보다 작은 세정맥, 6 µm보다 작은 세동맥에서는 미세혈관의 직경과 혈류 속도가 유의한 상관관계가 없음을 보였다.18 본 연구에서는 Koutsiaris18의 연구와 마찬가지로 결막미세혈관의 직경과 혈류 속도가 통계학적으로 유의한 결과를 보이지는 않았다. Shahidi et al16의 연구에서는 혈류 속도를 측정한 결막미세혈관의 평균 직경이 15.5 μm였으나, 본 연구에서는 결막미세혈관의 중앙값이 7.06 μm로 매우 작았다. 본 연구에서 직경이 굵은 혈관에서는 혈류의 끊김을 찾기 어려워 대체적으로 직경이 작은 미세혈관을 선택하여 혈류를 측정하였기 때문으로 생각된다.
또한 나이와 혈류 속도의 상관관계를 알아보았으나 통계학적으로 유의한 상관관계를 보이지 않았다(Spearman correlation analysis test, p=0.669). 문헌 검색에서 나이와 결막 미세혈관의 혈류 속도의 관계를 구한 연구는 찾을 수 없었으며, 이번 연구가 이에 대한 최초의 보고이다. 남녀 차이의 혈류 속도에 통계학적으로 유의한 차이가 있는지도 알아보고 싶었으나 실험군에 남성이 단지 1명이어서 이번 연구에서는 성별 간 혈류 속도의 차이에 대해서 알아볼 수 없었다.
이번 연구의 한계점으로는 첫 번째, 본 연구에서 10명의 10안에서 53개의 결막미세혈관을 분석하였는데 혈관을 세동맥, 세정맥, 모세혈관 등으로 종류를 구분하지 않았다는 점이다. 혈관의 종류를 분류하여 혈관의 종류에 따른 혈류 속도를 구할 수 있었다면 더 좋았을 것이다. 두 번째는 피험자 수가 10명으로 부족하다는 점이다. 하지만 각 환자당 여러 군데에서 결막미세혈관 내 혈류를 측정하여 총 53개 결막미세혈관의 혈류 속도를 측정하였으며 그 혈류 속도가 정규분포한다는 것까지 밝혔다. 추후 연구에서는 피험자 수를 더 늘려 결막미세혈관 내 혈류 속도를 측정해볼 수 있을 것이다.
이번 연구에서 결막미세혈관의 혈류를 측정하여 전신 질환을 진단하거나 다양한 질환에서 결막미세혈관 내 혈류 속도를 비교하고자 한 것이 아니다. 같은 눈에서도 직경에 따라, 위치에 따라 혈류가 매우 다를 것으로 생각된다. 다만, 다른 이공계 연구자들의 도움 없이 줌렌즈와 초고속 카메라 그리고 안과의사라면 누구나 사용하고 있는 세극등현미경을 사용하여 혈류를 촬영하고 혈류 속도를 측정할 수 있는 방법을 개발하였다는 데 큰 의의가 있겠다. 현재로서는 이러한 방법이 안과 연구에 어떻게 이용될지 예측하기는 어렵지만 추후에 전신 질환과 미세혈관 내 혈류 속도 또는 안구 질환과 미세혈관 내 혈류 속도의 연구에 유용하게 쓰일 수 있기를 기대한다. 본 방법은 기존 논문에서 기술한 방법에 비하여 매우 쉽고 직관적인 방법으로 혈류를 측정하는 방법이며 기존에 보고된 결막 내 미세혈관의 혈류 속도와 유사한 결과를 얻을 수 있었다.
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