토끼 모델에서 실험적 건성안 유도를 위한 염화벤잘코늄 농도 비교

Benzalkonium Chloride for Experimental Dry Eye Induction in a Rabbit Model

Article information

J Korean Ophthalmol Soc. 2022;63(8):660-668
Publication date (electronic) : 2022 August 15
doi : https://doi.org/10.3341/jkos.2022.63.8.660
1Department of Medical Science Graduate School, Chonnam National University, Hwasun, Korea
2Department of Ophthalmology, Chonnam National University Medical School, Gwangju, Korea
윤희수1, 김유준2, 윤현정2, 윤경철,2
1전남대학교 대학원 의과학교실
2전남대학교 의과대학 안과학교실
Address reprint requests to Kyung Chul Yoon, MD, PhD Department of Ophthalmology, Chonnam National University Medical School, #42 Jebong-ro, Dong-gu, Gwangju 61469, Korea Tel: 82-62-220-6753, Fax: 82-62-227-1642 E-mail: kcyoon@jnu.ac.kr
Received 2022 January 27; Revised 2022 April 16; Accepted 2022 July 18.

Abstract

목적

본 연구는 토끼 모델에서 0.05%, 0.1%, 0.2% 농도의 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride, BAC) 점안액이 임상인자 및 조직학적 소견에 미치는 영향에 대해 비교 분석하고자 하였다.

대상과 방법

0.05%, 0.1%, 0.2% 농도의 BAC 실험군 및 대조군을 분류하였으며, 각 군당 3마리의 토끼를 사용하였다. 세 가지 농도의 BAC를 양안에 1회 2 μL, 1일 2회 총 14일간 국소 점안하였다. 그리고 baseline, 3일, 5일, 7일, 10일, 14일째에 토끼의 양안에서 눈물량, 눈물막 파괴시간 및 각막 형광염색점수를 측정하고 기록하였다. 건성안 유발 후 14일째에 모든 토끼를 안락사시키고 안구 조직을 적출한 후 결막 내 술잔세포 농도 및 각막 상피 사멸세포수를 조사하였다.

결과

0.05% BAC군은 14일째, 0.1% BAC군은 10일째, 0.2% BAC군은 실험 5일째 baseline에 비해 눈물 분비량 및 눈물막 파괴시간이 감소하였고 각막 형광염색점수가 증가하였다(모두 p<0.05). 조직 검사 결과 대조군에 비하여 모든 실험군들의 결막 내 술잔세포수가 감소하였으며 각막 사멸세포수는 증가하였다(모두 p<0.01). 특히, 결막 내 술잔세포수는 0.05% BAC군에 비해 0.2% BAC군에서 더 낮았으며, 각막 상피 사멸세포수는 모든 실험군에서 각 군 간 차이를 보였다(모두 p<0.01).

결론

0.2% BAC의 사용은 다른 농도의 BAC에 비해 초기에 임상적으로 의미가 있는 건성안 토끼 모델을 만들 수 있을 것으로 판단된다.

Trans Abstract

Purpose

This study compared the clinical parameters and histological findings according to the benzalkonium chloride concentration (BAC; 0.05%, 0.1%, and 0.2%) for inducing experimental dry eye (EDE) in a rabbit model.

Methods

Rabbits were divided into four groups according to the BAC concentration: untreated group, 0.05%, 0.1%, and 0.2% BAC. BAC was instilled topically in both eyes of the rabbits twice daily until they were euthanized after 14 days. Tear volume, tear break-up time (TBUT), and corneal fluorescein staining score (CFS) were measured 0, 3, 5, 7, and 14 days after treatment. After excising tissues on day 14, the conjunctival goblet cell density and corneal epithelial apoptosis were quantified.

Results

The tear volume and TBUT were lower and the CFS was higher than baseline values after 14, 10, and 5 days in the 0.05, 0.1, and 0.2% BAC groups, respectively (all p < 0.05). At 14 days, the 0.2% BAC group showed more significant aggravation of all clinical parameters, and the 0.1% BAC group had a lower CFS (all p < 0.05) than the 0.05% BAC group. In all BAC groups, the conjunctival goblet cell density was lower and corneal epithelial apoptosis was significantly higher than in the untreated group (all p < 0.01). The conjunctival goblet cell density was lower in the 0.2% BAC group than in the 0.05% BAC group. Between-group differences in corneal epithelial apoptosis were observed in all experimental groups (all p < 0.01).

Conclusions

Instilling BAC for 14 days induced EDE in the 0.05, 0.1, and 0.2% BAC groups. Although 0.2% BAC cannot be used for a severe EDE model, it is useful for inducing EDE in a rabbit model in a short time.

건성안은 우리나라 성인의 약 20%를 차지하고 있으며 최근 5년간의 조사 결과 발생률이 매년 2.1%씩 증가하고 있는 주요한 질환 중 하나이다[1]. 최근 건성안의 개념이 바뀌면서 건성안은 불편감의 증상, 시력 장애, 눈물막 불안정과 안구 표면의 손상을 일으키며, 눈물의 삼투압의 증가 및 안구 표면의 염증을 동반하는 눈물막과 안구 표면의 다인자 질환으로 정의되고 있다[2,3]. 따라서 건성안의 기전을 규명하고 치료에 대한 전임상 연구를 시행하기 위해 실험적 건성안 동물 모델의 확립은 매우 필수적이라고 할 수 있다[4].

현재 건성안 연구를 위해 여러 가지 동물 모델들을 이용하여 실험을 진행하고 있으며 대표적인 동물은 마우스, 랫트, 토끼, 개가 있다. 가장 널리 사용되고 있는 동물은 마우스로, 몇몇 실험적 건성안 유도를 위한 실험에서 C57BL/6 마우스에게 팬을 이용하여 건조 스트레스를 주었을 때 염증성 사이토카인, 결막 고블렛 세포 밀도, 결막 CD4+T 세포 밀도의 증가를 보였으며, 건조 스트레스만으로도 C57BL/6 마우스에서 건성안을 유발하고 scopolamine 주사로 2주간 유지될 수 있음을 확인하였다[5,6].

토끼는 설치류에 비해 인간과 비슷한 눈물샘 구조 등의 유전학적 배경을 가지고 있으며, 넓은 안구 표면을 가지고 있어 새로운 치료 방법을 적용한 건성안 평가를 시행하기 유리하다[4]. 토끼를 이용한 실험용 건성안 모델을 만들기 위한 방법으로 (1) 건조 스트레스 및 건조 스트레스와 함께 scopolamine 피하주사를 시행하는 방법, (2) 아트로핀, 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride, BAC) 등을 이용한 각막 손상을 유도하는 방법, (3) 눈물분비 장애 유발을 위한 concanavalin A주입, 자가면역 눈물샘염 유도, 눈물샘 절제술, 도관로 상처, 신경 절단 등의 다양한 방법이 존재한다[4,710].

이 중, BAC를 이용하여 안구 표면 손상을 유도하는 방법은 예민한 동물인 토끼에게 쉽게 적용 가능하며, 임상인자 및 조직학적 소견이 건성안에서 보이는 소견과 유사하여 가장 흔하게 사용되고 있다[4,11]. 2008년 Xiong et al [12] 의 보고에 의하면 토끼에서 0.1% BAC를 하루 2회 2주간 국소 점안하는 방법은 각막 상피점수를 증가시키고, 눈물막 파괴시간 및 눈물 분비량을 감소시키며, 결막 내 술잔세포 밀도와 뮤신층의 두께 또한 감소하였음을 확인하여 실험적 건성안의 유도를 위해 가장 적합하다고 발표한 바가 있다. 그러나 2020년 Carpena-Torres et al [11]은 0.2% 고농도의 BAC를 이용하여 통상적인 방법보다 짧은 유도시간만으로 적합한 건성안 모델을 만들 수 있다고 제안하였다.

2018년 Chen et al [13]의 in vitro연구에서 BAC가 용량 의존적으로 세포의 형태, 생존, 증식, 분화에 영향을 미친다고 밝힌 바가 있어, 다양한 농도의 BAC를 다양한 기간 적용하여 실험 목적에 따라 여러 중증도를 가진 건성안 토끼 모델을 만들 수 있을 것으로 기대하였다. 따라서 본 연구에서는 0.05%, 0.1%, 0.2%의 다른 농도의 BAC를 사용하여 3일, 5일, 7일, 10일, 14일 시점의 임상인자를 측정함으로써 건성안의 유발 정도를 확인하고자 하였고, 농도에 따른 결막 내 술잔세포 및 각막 상피 사멸세포수에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

Mean tear volume, tear break-up time, and corneal fluorescein staining score in the untreated (UT), 0.05% benzalkonium chloride (BAC), 0.1% BAC and 0.2% BAC treated groups

대상과 방법

실험 대상

본 실험은 동물 보호 및 사용 위원회 승인 후 진행되었으며(CNUHIACUC-20022), 본 기관의 지침을 따라 2.0-2.5 kg의 뉴질랜드 암컷 알비노 토끼를 대상으로 실험이 진행되었다. 2주간 각기 다른 농도의 BAC를 안구에 점안하여 그 효과를 알아보고자 하였다. 실험 중 결막을 포함한 안구에 감염이 발생한 경우 실험군에서 제외를 하였다. BAC를 넣지 않는 대조군, 0.05% BAC를 사용한 군, 0.1% BAC를 사용한 군, 0.2% BAC를 사용한 군으로 점안액의 농도에 따라 분류하였다. BAC는 평형염액(BSS; Alcon, Fort Worth, TX, USA)을 이용하여 희석하였다. 각 군당 3마리씩 설정하여 총 12마리의 토끼에게서 다양한 BAC 농도의 효과를 조사하였다.

대조군을 제외한 0.05%, 0.1%, 0.2% 농도의 BAC 실험군에서 양안에 1회 2 µL, 1일 2회 점안하였으며, 총 14일간 진행하였다. 점안액이 토끼 눈물 및 안구 표면에 미치는 영향을 확인하고자 모든 토끼의 양안에서 0일째, 3일째, 5일째, 7일째, 10일째에 눈물 분비량, 눈물막 파괴시간을 측정하고 각막 형광염색점수를 조사하였다. 그리고 유발 14일째에 눈물 분비량, 눈물막 파괴시간, 각막 형광염색점수 조사 후 케타민(30 mg/kg; Yuhan, Seoul, Korea)과 자일라진(6 mg/kg; Bayer, Leverkusen, Germany)을 사용하여 토끼를 마취하고 염화칼륨(KCl)을 심장에 주입하여 희생시켰다. 안구조직을 적출하여 결막 내 술잔세포 농도와 각막에서의 각막 상피세포 사멸수를 관찰하였다.

검사를 통한 분석

눈물 분비량 측정

눈물 분비량을 측정하기 위해 5×35 mm 규격의 멸균된 쉬르머 테스트지(ColorBar; Eagle Vision Inc., Memphis, TN, USA)를 사용하였다. 쉬르머 테스트지를 토끼의 결막낭에 접촉시켰고, 20초를 센 후에 쉬르머 테스트지를 빼고 눈물에 젖어 파란색으로 변한 표면의 길이(mm)를 측정하여 기록하였다.

눈물막 파괴시간 측정

건성안에 있어 가장 중요한 임상인자인 눈물막의 안정성(tear film stability)을 판단하는 눈물막 파괴시간 검사를 위해, 토끼의 아래쪽 결막낭에 1% 형광염색액(fluorescein) 2 µL을 점안한 후 3회 정도의 눈깜박임을 시키고 부드럽게 벌린 다음, Cobalt blue filter가 장착된 세극등현미경을 통해 염색된 눈물막에 첫 번째 결손이 생길 때까지의 시간(초)을 측정하였다. 그리고 이를 3회 반복 시행하여 평균값을 구하였다.

각막 형광염색 점수 측정

1% 형광염색액(fluorescein)을 2 µL씩 점안한 후 식염수로 세척하고, 토끼의 각막을 세극등현미경으로 관찰하여 상피 손상 정도 즉, 형광염색이 묻어나는 정도를 점수화하여 평가하였다. 정확한 평가를 위해 각막을 4개의 구역으로 나눈 다음, 각 등분을 아래와 같이 0-4점까지 평가한 후 합산하였다(총 0-16점) [5]: 0점, 형광 염색 부재; 1점, 약간의 염색이 있는 상태 <30 spots; 2점, 작은 반점의 염색 >30 spots, 확산되지 않은 상태; 3점, 심하게 확산되어 염색이 되었으나 양성 플라크는 없는 상태; 4점, 양성 형광 플라크로 인한 심하게 확산되어 염색된 상태.

조직학적 검사를 통한 분석

각 개체마다 우안을 적출하여 1군당 3안의 결과를 분석하였다. 토끼의 결막을 절제하여 4% 파라포름알데하이드에 고정하고 파라핀에 포매시킨 다음 눈 조직을 실온에서 4 µm 두께로 잘라냈다. 파라핀 제거 후, 젤라틴을 입힌 슬라이드에 부착하였다. 그리고 과요오드산-쉬프염색로 염색을 시행하였다. 현미경과 image-analysis소프트웨어를 이용하여 각 단면에서 결막 내 술잔세포의 밀도를 계산하였다.

토끼의 각막을 절제하여 4% 파라포름알데하이드에 고정하고 파라핀에 포매시킨 다음 조직의 단면에 TUNEL 염색을 시행하였다. 콘포칼 현미경과 image-analysis소프트웨어를 이용하여 각 단면에서 각막 상피 사멸세포수의 정도를 확인하였다.

통계학적 분석

SPSS ver. 18.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)에서 눈물 분비량, 눈물막 파괴시간, 각막 형광염색 점수는 반복적인 분산(RM-ANOVA) 검정을 시행하였고, 군 간의 결막 내 술잔세포 농도와 각막 상피 사멸세포수 차이를 비교하기 위해 Kruskal-Wallis와 Mann-Whitnet U 검사를 이용하여 확인하였다. 사후 검정을 위해 Bonferroni 교정을 시행하였다. 그리고 p값이 0.05 이하인 경우 통계학적으로 유의한 값이라 정의하였다.

결 과

눈물 분비량

건성안 유발 3일째군 간의 눈물 분비량 측정값은 통계적으로 유의한 차이가 없었다(모두 p>0.05). 유발 5일째, 0.2% BAC군(9.83 ± 1.03 mm)은 UT군(13.33 ± 1.26 mm; p<0.01)에 비해 평균 눈물량이 유의하게 감소하였다. 7일째부터 0.2% BAC군(9.00 ± 1.75 mm)은 UT군(13.33 ± 1.26 mm; p<0.01)과0.05% BAC군(11.17 ± 1.38 mm; p<0.01)에 비해 눈물 분비량의 차이를 보였다. 실험 10일째, 0.1% BAC군(8.00 ± 0.81 mm)은 UT군(12.50 ± 1.26 mm; p<0.01)에 비해 눈물 분비량의 차이를 보였고, 14일째에는 0.05% BAC군(7.67 ± 0.75 mm)에서도 UT군(12.33 ± 1.26 mm; p<0.01)에 비해 눈물 분비량이 감소함으로 모든 실험 농도에서 눈물 분비량이 baseline에 비해 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(all p<0.05) (Fig. 1).

Figure 1.

Mean tear volume in the untreated (UT), 0.05% benzalkonium chloride (BAC), 0.1% BAC and 0.2% BAC treated groups at baseline and days 3, 5, 7, 10, and 14. *p < 0.05 versus UT; p < 0.05 versus 0.05% BAC.

눈물막 파괴시간

건성안 유발 3일째군 간의 눈물막 파괴시간 측정값은 통계적으로 유의한 차이가 없었다(모두 p>0.05). 유발 5일째 0.2% BAC군(8.81 ± 1.03초)은 UT군(11.21 ± 1.26초; p<0.01)에 비해 평균 눈물막 파괴시간이 유의하게 감소하였다. 7일째 0.2% BAC군(7.86 ± 1.75초)은 0.05% BAC군(9.81 ± 1.38초; p=0.02)에 비해서도 눈물막 파괴시간의 차이를 보였다. 10일째는 0.1% BAC군(7.70 ± 0.81초) 또한 UT군(9.99 ± 1.26초; p<0.01)에 비해 눈물막 파괴시간의 차이를 보였고, 14일째에는 0.05% BAC군(7.69 ± 1.38초)에서도 UT군(9.81 ± 1.47초; p<0.01)에 비해 눈물 분비량이 감소함으로 모든 실험 농도에서 눈물 분비량이 baseline에 비해 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다(모두 p<0.05) (Fig. 2).

Figure 2.

Mean tear film break-up time in the untreated (UT), 0.05% benzalkonium chloride (BAC), 0.1% BAC and 0.2% BAC treated groups at baseline and days 3, 5, 7, 10, and 14. *p < 0.05 versus UT; p < 0.05 versus 0.05% BAC.

각막 형광색소염색 점수

건성안 유발 3일째군 간의 각막 형광색소염색 점수값은 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 유발 5일 및 7일째에서 0.2% BAC군(4.17 ± 1.03점 and 6.33 ± 1.75점)은 UT군(2.33 ± 1.26점 and 3.17 ± 1.47점; p=0.04 and 0.02)에 비해 각막 형광색소염색 점수의 값이 유의하게 증가하였다. 실험 10일째 0.1% BAC군(8.50 ± 0.81점)은 UT군(4.00 ± 1.26점; p=0.02)과 비교하여 유의한 각막 형광색소염색 점수의 증가를 보였고, 0.2% BAC군(10.50 ± 0.81점)은 0.05% BAC군(6.83 ± 0.75점; p<0.01)에 비해서도 증가하였다. 14일째는 UT군에서 4.33 ± 1.26점, 0.05% BAC군에서 9.00 ± 1.47점, 0.1% BAC군에서 12.33 ± 1.03점, 0.2% BAC군에서 15.17 ± 1.03점으로, 0.05% BAC군은 UT군과 차이를 보였고(p<0.01), 0.1% BAC군 또한 0.05% BAC군과 유의한 차이를 보였다(p=0.02). 14일 점안 후 모든 BAC 실험군에서 각막 형광색소염색 점수가 baseline에 비해 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(모두 p<0.05) (Fig. 3). 각막의 형광색소염색 점수 외 각막혼탁 및 궤양, 신생혈관 등의 합병증은 관찰되지 않았다.

Figure 3.

Mean corneal fluorescein staining score (A) and representative figures (B) in the untreated (UT), 0.05% benzalkonium chloride (BAC), 0.1% BAC and 0.2% BAC treated groups at baseline and days 3, 5, 7, 10, and 14. *p < 0.05 versus UT; p < 0.05 versus 0.05% BAC.

결막 내 술잔세포

결막 내 술잔세포수는 UT군에서 61.67 ± 7.42 cells/100 µm, 0.05% BAC군에서 29.00 ± 4.10 cells/100 µm, 0.1% BAC군에서 23.83 ± 3.00 cells/100 µm, 0.2% BAC군에서 18.67 ± 3.50 cells/100 µm였다. 0.05%, 0.1% 및 0.2% BAC군 모두 UT군에 비해 결막 내 술잔세포수가 감소하였으며(모두 p<0.01), 특히 0.2% BAC군은 0.05% BAC군에 비해서도 세포수가 감소하였다(p<0.01) (Fig. 4).

Figure 4.

Mean goblet cell density (A) and representative figures (B) in the untreated (UT), 0.05% benzalkonium chloride (BAC), 0.1% BAC and 0.2% BAC treated groups at 2 weeks. *p < 0.05 versus UT; p < 0.05 versus 0.05% BAC.

각막 상피 사멸세포수

각막 상피 사멸세포수는 UT군에서 3.00 ± 1.27 cells/100 µm, 0.05% BAC군에서 9.00 ± 2.10 cells/100 µm, 0.1% BAC군에서 14.33 ± 3.89 cells/100 µm, 0.2% BAC군에서 23.00 ± 4.60 cells/100 µm였다. 0.05%, 0.1% 및 0.2% BAC군에서 모두 UT군에 비하여 각막 상피 사멸세포수가 증가하였다(모두 p<0.01). 0.1% BAC군은 0.05% BAC군(p<0.01)에 비해 증가하였으며, 0.2% BAC군은 0.05% BAC군(p<0.01) 및 0.1% BAC군(p<0.01)에 비해서 각막 상피 사멸세포수가 증가하였다(Fig. 5).

Figure 5.

Mean TUNEL positive cells (A) and representative figures (B) in the untreated (UT), 0.05% benzalkonium chloride (BAC), 0.1% BAC and 0.2% BAC treated groups at 2 weeks. *p < 0.05 versus UT; p < 0.05 versus 0.05% BAC; p < 0.05 versus 0.1% BAC.

고 찰

건성안은 2017년 DEWS II (The Tear Film & Ocular Surface Society International Dry Eye Workshop II)의 발표에 의해 안구 표면의 다요인성 질병으로 눈물막의 항상성을 상실하고, 안구 증상이 동반되는 특징을 가지며 눈물막의 불안정성과 고삼투압, 안구 표면의 염증 및 손상, 신경 감각 이상 등이 원인이 될 수 있다고 정의되었다[2,14]. 이 기전에 의하면 눈물막의 불안정성 또는 고삼투압으로 인해 염증 매개인자들이 방출되며, 염증 cascade가 유발되고, 결과적으로 안구 표면 상피세포들의 괴사 및 결막 술잔세포의 감소를 일으킨다[14].

건성안 연구를 위해 다양한 종류의 동물 모델이 사용되고 있으며, 이 중 토끼는 넓은 안구 표면과 설치류보다 더 인간과 유사한 안구의 특징을 가지고 있어 건성안의 새로운 치료 방법을 적용하는 데 효과적인 모델이다[4]. 여러 가지 실험 건성안 토끼 모델 중 가장 널리 사용되고 있는 방법은 BAC를 점안하는 방법인데, BAC는 상피세포의 tight junction을 파괴함으로써, 직접적으로 각막 및 결막 상피를 손상시키고 각막 상피 사멸세포수를 유발한다[10,15]. 이로 인해 결막 술잔세포는 감소하여, 이차적으로 안구 표면을 보호하는 눈물막의 불안정성이 발생하게 되고, intercellular adhesion molecule-1, interleukin-6, 8, 10 등의 상피 내의 염증 매개인자들이 증가하여 이는 또다시 눈물막의 불안정성을 초래하는 악순환이 발생하게 된다[10,16,17]. 따라서 BAC에 의한 건성안 유발 모델은 실제 임상에서의 건성안의 발병기전과 유사한 매우 유용한 모델이라고 할 수 있다[10].

기존 연구에서 BAC의 농도와 기간에 대한 연구는 여러 차례 이루어져 있으나[4,11,12], 본 연구에서는 추가적으로 세 가지 다른 농도의 BAC를 이용하여 여러 시점에 임상인자를 측정함으로써 건성안 유발에 소요되는 기간과 중증도를 비교하고, 여러 중증도를 가진 건성안 토끼 모델을 만들 수 있을지 확인하고자 하였다. 따라서, 본 연구에서는 0.05%, 0.1% 및 0.2%의 다른 농도의 BAC를 사용하여 3일, 5일, 7일, 10일, 14일 시점의 임상인자를 측정함으로써 건성안의 유발 정도를 확인하였고, 농도에 따른 결막 내 술잔세포 및 각막 상피 사멸세포수에 미치는 영향을 비교하였다.

그 결과 0.2% BAC군에서 눈물 분비량, 눈물막 파괴시간, 각막 형광색소염색 점수 모두 5일째에 UT군에 비해 유의한 악화가 있었으며, 14일째에는 0.05%, 0.1% 및 0.2% BAC군 모두 UT군에 비해서 세 가지 인자 모두 유의한 감소가 있었다. 0.05% BAC는 점안 14일째, 0.1% BAC는 10일째, 0.2% BAC는 점안 5일째부터 건성안 임상인자의 악화가 나타났다. 실험 14일째, 0.2% BAC군은 0.05% BAC군에 비해 세 가지 임상인자 모두 통계적으로 유의한 악화를 보였으나, 0.1% BAC군과는 유의한 차이가 없었다. 결막 내 술잔세포 농도 및 각막 상피 사멸세포수 또한 0.05%, 0.1% 및 0.2% BAC군에서 UT군에 비하여 모두 유의하게 감소하였다. 결막 내 술잔세포 농도는 0.2% BAC군에서 0.05% BAC군에 비해 감소되었으나, 0.1% BAC군과 유의한 차이가 없었고, 각막 상피 사멸세포수는 0.1% BAC군은 0.05% BAC군에 비해서 유의하게 증가하였으며 0.2% BAC군은 0.1% BAC군에 비해서도 유의하게 증가한 것으로 나타났다.

2021년 Singh et al [4]과 2008년 Xiong et al [12]은 0.1% BAC를 하루 2회 2주간 점안하는 방법은 각막 상피 점수를 증가시키고, 눈물막 파괴시간 및 눈물 분비량을 감소시키며, 결막 내 술잔세포 농도와 뮤신층의 두께 또한 감소하였음을 확인하여 토끼에서 실험적 건성안의 유도를 위해 가장 적합하다고 발표한 바가 있으며 현재 가장 널리 사용하고 있는 방법이다. 본 연구에서 또한 14일의 유도 후 0.1%와 0.2% BAC군 간 각막 상피 사멸세포수 외에 다른 인자의 유의한 차이가 없어, 2주 정도의 유도 기간을 가질 때에는 0.1% 농도의 BAC로도 충분하며, 고농도의 BAC를 사용한다고 하더라도 기존 방법보다 더 심한 건성안을 유발하지는 않는 것으로 판단된다. 0.05% BAC군은 UT군에 비해 모든 건성안 인자에서 유의하게 악화된 소견을 보였으나, 14일째 결과에서 각막 상피 사멸세포수뿐만 아니라 임상인자인 각막 상피 점수가 0.1% BAC 군에 비해 통계적으로 유의하게 낮아 경증의 건성안 모델이 필요할 경우 사용을 고려해볼 수 있을 수 있을 것으로 사료된다.

2020년 Carpena-Torres et al [11]은 0.2% 고농도의 BAC를 이용하여 통상적인 방법보다 5일이라는 짧은 유도시간만으로 적합한 건성안 모델을 만들 수 있다고 제안하였는데, 본 연구 또한 이전 연구와 마찬가지로0.2% BAC 점안 후 5일만에 눈물 분비량, 눈물막 파괴시간, 각막 형광색소염색 점수 모두 UT군에 비해 유의한 악화를 보였다. 따라서 0.2% BAC의 점안은 보다 심한 건성안을 유발하기 위한 방법이기보다는 유도 기간의 단축이 필요할 때 유용한 방법이 될 수 있을 것으로 보인다.

본 연구의 한계점으로는 3가지 농도의 BAC의 군의 임상인자는 투여 기간에 따라 비교 분석하였으나, 조직 분석은 실험이 다 끝난 2주 후에만 분석하였다는 점과 실험 기간을 2주로 설정하여, 좀 더 장기간 투여했을 때의 임상 소견을 확인하지 못한 점이 있다. 본 연구에서 0.2% 점안은 보다 심한 건성안 유발보다는 유도 기간의 단축에 유용하다고 결론 내렸으나, 좀 더 장기간 사용시 0.1% BAC군에 비해 통계적으로 유의한 악화가 있을 가능성도 존재한다. 단, 이러한 경우에는 각막 궤양 및 각막 신생혈관 등의 합병증이 발생할 가능성도 더 높아지므로 지나친 실험 기간의 연장은 건성안 모델의 확립을 위한 실험에는 적절하지 않을 수 있겠다[4]. 또한, 본 연구에서는 통계 분석을 위한 최소 개체수인 1군당 3마리의 토끼를 실험에 사용하였는데, 타 연구에 비해 비교적 적은 수의 개체를 실험에 사용하였다는 점도 한계점이 될 수 있다. 다수의 개체를 사용했을 경우 통계적으로 유의성을 획득하지 못한 결과 또한 유의한 결과를 보였을 가능성도 존재한다. 향후 본 연구의 한계점을 보완한 추가적인 연구가 필요하리라 생각된다.

본 연구에서는 건성안 유발을 시작하고 3일째, 5일째, 7일째, 10일째, 14일째에 눈물 분비량, 눈물막 파괴시간, 각막 형광색소염색 점수를 확인하였고, 14일째 토끼를 희생시킨 후 결막 내 술잔세포 농도, 면역형광염색을 통한 각막상피 사멸세포수를 확인하였다. 0.05% BAC는 점안 14일째, 0.1% BAC는 10일째, 0.2% BAC는 5일째부터 건성안 임상인자의 악화가 나타났다. 토끼 모델에서 BAC를 14일 동안 국소 적용을 하였을 때 0.05%, 0.1% 및 0.2% BAC 모두 실험적 건성안을 유도할 수 있다는 것이 확인되었다. 각막 상피 사멸세포수를 제외한 모든 인자에서 0.1%와 0.2% BAC군 간의 유의한 차이는 없었다. 유발 기간이 14일일 경우, 0.1% BAC 사용으로 충분한 실험적 건성안을 유발할 수 있으며, 0.2% BAC 사용이 보다 더 심한 건성안을 유발하지 않는다. 5일째부터 0.2% BAC의 국소 적용한 토끼의 안구 표면에서 눈물 분비와 눈물막 파괴시간이 감소하였고 각막 상피 손상이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 0.2% BAC의 사용은 다른 농도의 BAC에 비해 초기에 임상적으로 의미가 있는 건성안 토끼 모델을 만들 수 있을 것으로 판단된다.

Notes

Conflicts of Interest

The authors have no conflicts to disclose.

References

1. Stapleton F, Alves M, Bunya VY, et al. TFOS DEWS II epidemiology report. Ocul Surf 2017;15:334–65.
2. Craig JP, Nichols KK, Akpek EK, et al. TFOS DEWS II definition and classification report. Ocul Surf 2017;15:276–83.
3. Willcox MDP, Argüeso P, Georgiev GA, et al. TFOS DEWS II tear film report. Ocul Surf 2017;15:366–403.
4. Singh S, Sharma S, Basu S. Rabbit models of dry eye disease: current understanding and unmet needs for translational research. Exp Eye Res 2021;206:108538.
5. Yoon KC, Ahn KY, Choi W, et al. Tear production and ocular surface changes in experimental dry eye after elimination of desiccating stress. Invest Ophthalmol Vis Sci 2011;52:7267–73.
6. Yoon KC, De Paiva CS, Qi H, et al. Expression of Th-1 chemokines and chemokine receptors on the ocular surface of C57BL/6 mice: effects of desiccating stress. Invest Ophthalmol Vis Sci 2007;48:2561–9.
7. Chen XM, Kuang JB, Yu HY, et al. A novel rabbit dry eye model induced by a controlled drying system. Transl Vis Sci Technol 2021;10:32.
8. Lantyer-Araujo NL, Lacerda AJ, Mendonça MA, et al. Rabbit as an animal model for ocular surface disease, tear osmolarity, electrolyte, and tear ferning profiles. Optom Vis Sci 2020;97:847–51.
9. Li N, Deng X, Gao Y, et al. Establishment of the mild, moderate and severe dry eye models using three methods in rabbits. BMC Ophthalmol 2013;13:50.
10. Li C, Song Y, Luan S, et al. Research on the stability of a rabbit dry eye model induced by topical application of the preservative benzalkonium chloride. PLoS One 2012;7e33688.
11. Carpena-Torres C, Pintor J, Pérez de Lara MJ, et al. Optimization of a rabbit dry eye model induced by topical instillation of benzalkonium chloride. J Ophthalmol 2020;2020:7204951.
12. Xiong C, Chen D, Liu J, et al. A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride. Invest Ophthalmol Vis Sci 2008;49:1850–6.
13. Chen X, Sullivan DA, Sullivan AG, et al. Toxicity of cosmetic preservatives on human ocular surface and adnexal cells. Exp Eye Res 2018;170:188–97.
14. Bron AJ, de Paiva CS, Chauhan SK, et al. TFOS DEWS II pathophysiology report. Ocul Surf 2017;15:438–510.
15. Uematsu M, Kumagami T, Kusano M, et al. Acute corneal epithelial change after instillation of benzalkonium chloride evaluated using a newly developed in vivo corneal transepithelial electric resistance measurement method. Ophthalmic Res 2007;39:308–14.
16. Solomon A, Dursun D, Liu Z, et al. Pro- and anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001;42:2283–92.
17. De Saint Jean M, Brignole F, Bringuier AF, et al. Effects of benzalkonium chloride on growth and survival of Chang conjunctival cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 1999;40:619–30.

Biography

윤희수 / Hee Su Yoon

전남대학교 대학원 의과학교실

Department of Medical Science Graduate School, Chonnam National University

Article information Continued

Figure 1.

Mean tear volume in the untreated (UT), 0.05% benzalkonium chloride (BAC), 0.1% BAC and 0.2% BAC treated groups at baseline and days 3, 5, 7, 10, and 14. *p < 0.05 versus UT; p < 0.05 versus 0.05% BAC.

Figure 2.

Mean tear film break-up time in the untreated (UT), 0.05% benzalkonium chloride (BAC), 0.1% BAC and 0.2% BAC treated groups at baseline and days 3, 5, 7, 10, and 14. *p < 0.05 versus UT; p < 0.05 versus 0.05% BAC.

Figure 3.

Mean corneal fluorescein staining score (A) and representative figures (B) in the untreated (UT), 0.05% benzalkonium chloride (BAC), 0.1% BAC and 0.2% BAC treated groups at baseline and days 3, 5, 7, 10, and 14. *p < 0.05 versus UT; p < 0.05 versus 0.05% BAC.

Figure 4.

Mean goblet cell density (A) and representative figures (B) in the untreated (UT), 0.05% benzalkonium chloride (BAC), 0.1% BAC and 0.2% BAC treated groups at 2 weeks. *p < 0.05 versus UT; p < 0.05 versus 0.05% BAC.

Figure 5.

Mean TUNEL positive cells (A) and representative figures (B) in the untreated (UT), 0.05% benzalkonium chloride (BAC), 0.1% BAC and 0.2% BAC treated groups at 2 weeks. *p < 0.05 versus UT; p < 0.05 versus 0.05% BAC; p < 0.05 versus 0.1% BAC.

Table 1.

Mean tear volume, tear break-up time, and corneal fluorescein staining score in the untreated (UT), 0.05% benzalkonium chloride (BAC), 0.1% BAC and 0.2% BAC treated groups

UT 0.05% BAC 0.1% BAC 0.2% BAC
Tear volume (mm)
 Baseline 14.17 ± 1.05 14.50 ± 1.03 14.33 ± 1.05 14.50 ± 1.05
 Day 3 13.83 ± 1.41 13.00 ± 0.89 12.00 ± 1.04 11.67 ± 1.04
 Day 5 13.33 ± 1.26 11.83 ± 1.47 11.17 ± 1.03 9.83 ± 1.03*
 Day 7 12.83 ± 1.47 11.17 ± 1.38 10.83 ± 1.75 9.00 ± 1.75*,†
 Day 10 12.50 ± 1.26 10.33 ± 0.75 8.00 ± 0.81* 6.83 ± 0.81*,†
 Day 14 12.33 ± 1.26 7.67 ± 0.75* 6.00 ± 0.81* 4.17 ± 0.81*,†
Tear break-up time (seconds)
 Baseline 12.25 ± 1.05 12.20 ± 1.32 12.43 ± 1.05 12.58 ± 1.05
 Day 3 11.75 ± 1.41 11.10 ± 0.89 10.69 ± 1.04 10.32 ± 1.04
 Day 5 11.21 ± 1.26 10.45 ± 1.47 9.69 ± 1.03 8.81 ± 1.03*
 Day 7 10.55 ± 1.47 9.81 ± 1.38 9.10 ± 1.75 7.86 ± 1.75*,†
 Day 10 9.99 ± 1.26 8.88 ± 0.75 7.70 ± 0.81* 6.33 ± 0.81*,†
 Day 14 9.81 ± 1.47 7.69 ± 1.38* 6.39 ± 1.75* 5.12 ± 1.75*,†
Corneal fluorescein staining score (score)
 Baseline 1.67 ± 1.05 1.83 ± 1.03 2.00 ± 1.05 1.83 ± 1.05
 Day 3 1.83 ± 1.41 2.33 ± 0.89 2.50 ± 1.04 3.00 ± 1.04
 Day 5 2.33 ± 1.26 3.33 ± 1.47 2.83 ± 1.03 4.17 ± 1.03*
 Day 7 3.17 ± 1.47 4.67 ± 1.38 5.50 ± 1.75 6.33 ± 1.75*
 Day 10 4.00 ± 1.26 6.83 ± 0.75 8.50 ± 0.81* 10.50 ± 0.81*,†
 Day 14 4.33 ± 1.26 9.00 ± 1.47* 12.33 ± 1.03*,† 15.17 ± 1.03*,†

Values are presented as mean ± standard deviation.

*

p < 0.05 versus UT and p < 0.05 versus 0.05% BAC using repeated measures analysis of variance with Bonferroni’s correction.